核糖核酸酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)(RPA)基本原理
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2019-12-27 16:39
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核糖核酸酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)(Ribonuclease protection assay,RPA)是近十年發(fā)展起來(lái)的一種全新的mRNA定量分析方法。其基本原理是將標(biāo)記的特異RNA探針(32P或生物素)與待測(cè)的RNA樣品液相雜交,標(biāo)記的特異RNA探針按堿基互補(bǔ)的原則與目的基因特異性結(jié)合,形成雙鏈RNA;未結(jié)合的單鏈RNA經(jīng)RNA酶A或RNA酶T1消化形成寡核糖核酸,而待測(cè)目的基因與特異RNA探針結(jié)合后形成雙鏈RNA,免受RNA酶的消化,故該方法命名為RNA酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)。對(duì)于32P標(biāo)記的探針,雜交雙鏈進(jìn)行變性聚丙酰胺凝膠電泳,用放射自顯影或磷屏成像系統(tǒng)檢測(cè)被保護(hù)的探針的信號(hào); 對(duì)于生物素標(biāo)記的探針,雜交雙鏈經(jīng)過(guò)變性聚丙酰胺凝膠電泳后電轉(zhuǎn)移至尼龍膜,采用鏈霉親和素-辣根過(guò)氧化物酶(Streptavidin-HRP)和化學(xué)發(fā)光底物與膜上biotin標(biāo)記的探針結(jié)合,X射線(xiàn)膠片或化學(xué)發(fā)光圖像分析儀檢測(cè)雜交信號(hào)。
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